一、范围

本标准规定了高效液相色谱仪主要性能的测试方法。

本标准适用于高效液相色谱仪(HPLC)、超高效液相色谱仪(UPLC)。

本标准测试方法分为单元部件和仪器整机两部分。

二、规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改版)适用于本文件。

GB/T-分析仪器环境试验方法GB/T-高效液相色谱仪

GB/T-色谱数据工作站GB/T-液相色谱仪测试用标准色谱柱

GB/T-分析仪器性能测定术语

GB/T-液相色谱法术语柱色谱法和平面色谱法

JJG-液相色谱仪检定规程GB/T-分析实验室用水规格和试验方法

三、条件要求

3.1仪器工作条件

环境温度：15℃~35℃；

相对湿度：20%~80%；

供电电源：电压V±22V，频率50Hz±0.5Hz，并接地良好；

室内避免易燃、易爆和强腐蚀性气体及强烈震动、电磁干扰，有良好的通风装置。

3.2试验条件

试验用计量仪器、仪表和玻璃器皿等均按有关规定，经计量检定单位检定合格并满足量程和精度的要求；

标准溶液与试剂：标准溶液应使用满足相关标准的有证标准物质，并按照相关要求配制，各种试剂应使用优级纯或分析纯。

四、单元部件性能指标的测试

4.1恒流泵

4.1.1密封性

4.1.1.1设备与试剂

高压截止阀一个，耐压不小于仪器压力上限%；精密压力表一个，量程不小于仪器压力上限的%，0.4级；三通一个；秒表一块，分度值不大于0.1s。

纯水：二次蒸馏水，满足《GB/T-分析实验室用水规格和试验方法》中一级水要求，以下同。

4.1.1.2测试方法

通过三通将恒流泵、高压截止阀和精密压力表连接，恒流泵最高压力设定为仪器压力上限90%处。以纯水为流动相，待系统排出气体，流量设置为0.1mL/min；运行仪器，将高压截止阀处于截流状态，压力将逐渐上升，达到仪器压力上限90%时，停止运行；记录此时压力表示值p1，保持10min后，记录压力示值p2。按式(4-1)计算压力降。

4.1.2流量准确度与精密度

4.1.2.1设备与试剂

秒表一块，分度值不大于0.1s；带探针数字温度计一支，分度值不大于0.1℃；分析天平一台，根据流量大小选择合适载荷，测试质量控制在天平载荷的60%左右，准确度不低于II级，实际分度值不大于0.1mg；背压装置一个，在设定流量下可提供(8±2)MPa背压；合适规格的称量瓶三个。

纯水。

4.1.2.2测试方法

连接恒流泵入口、出口管路，以纯水为流动相(将数字温度计探针插入流动相内，测定此时流动相的温度)，分别设定仪器流量上限的1%、10%和50%，调整背压在(8±2)MPa。待仪器运行稳定后，按照表1要求收集流动相，采用秒表计时，记录数据。分别按照式(4-2)、式(4-3)计算流量准确度和精密度。

注：流量的设定可根据恒流泵的流量范围而定，此处以流量上限为10mL/min为例。

注：为方便起见，亦可采用检定合格的液体流量计(精度不低于0.01mL/min)测试流量准确度与精密度。

4.1.3压力脉动

4.1.3.1设备与试剂

精密压力表一个，量程不小于仪器压力上限的%，0.4级；背压装置一个：在设定1.0mL/min流量下，在0~30MPa范围内可调；秒表一块，分度值不大于0.1s。

纯水。

4.1.3.2测试方法

依次连接恒流泵、精密压力表、背压装置入口与出口管路，以纯水为流动相，设定流量为仪器流量上限的10%，调整背压为仪器压力上限的20%左右(如仪器压力上限为40MPa，则背压调整在(8±2)MPa；如仪器压力上限为MPa，则背压调整在(20±2)MPa)。待仪器运行稳定后，监测精密压力表示值，记录10min内的最大、最小压力值及平均值(每间隔1min读数一次，计算平均值)。按照式(4-4)计算压力脉动率δp。

4.2自动进样器

4.2.1进样准确度与精密度

4.2.1.1设备与试剂

分析天平一台，准确度不低于II级，实际分度值不大于0.1mg；2mL样品瓶若干。

纯水。

4.2.1.2测试方法

启动自动进样器，排除管路气泡，清洗进样针，取2mL的进样瓶，加入一定量的纯水，用分析天平称量，记录数据。按表2执行取样，每次取样结束后，均对进样瓶进行称量，记录数据。按式(4-5)和式(4-6)进行计算SS和SR，作为进样准确度与精密度*。

4.2.2线性

4.2.2.1设备与试剂

同4.2.1.1。

4.2.2.2测试方法

同4.2.1.2，依次设定进样体积为5uL，10uL，20uL，25uL，50uL(如样品环体积为uL)，每个体积连续测量三次，记录数据，取算术平均值m，与对应的取样体积作一元线性拟合校准曲线，得出线性相关系数r。

4.2.3残留

4.2.3.1设备与试剂

高效液相色谱仪系统一套，C18色谱柱一支(满足《GB/T-液相色谱仪测试用标准色谱柱》标准要求，理论塔板数不低于，以下同)。

0.1mg/mL的萘/甲醇溶液；85%甲醇水溶液。

4.2.3.2测试方法

将自动进样器连入测试用高效液相色谱仪系统中，采用C18色谱柱连接自动进样器出口与检测器入口，启动仪器，设置检测器波长为nm，以85%甲醇水溶液为流动相，流量设定为1.0mL/min，平衡系统。启动进样器，排除管路气泡，清洗进样针，取2mL的进样瓶，加入一定量的0.1mg/mL的萘/甲醇溶液，放入自动进样器托盘指定位置。设置自动进样器参数，进样前后各清洗1次(清洗体积为系统体积的3~5倍)，依次注入20uL的0.1mg/mL的萘/甲醇溶液和%甲醇溶液。重复测量三次，记录色谱峰面积，取算术平均值，按式(4-7)计算残留量。

4.2.4最小进样时间

在色谱数据工作站上设定分析方法，编辑序列，进样量设为20uL，选择不洗针模式，点击运行序列，同时用秒表计时，至完成进样，色谱工作站开始采集数据为止，记录此过程的时间为最小进样时间。

4.3色谱柱恒温箱

4.3.1温度准确度与精密度

4.3.1.1设备与试剂

校准过的带探针数字温度计一台，分度值不大于0.1℃；空色谱柱管一支。

4.3.1.2测试方法

将数字温度计探针放置在一支空色谱柱的中心，将空色谱柱固定在色谱柱温箱内放置色谱柱处，选择4℃(制冷1)、室温+10℃，40℃，温度上限的90%进行测量。按温度从低到高顺序升温，开机加热或制冷60min后，每隔5min记录一次数字温度计显示温度2，测试五次计算平均值。按照公式(4-8)和(4-9)计算温度准确度与精密度。

式中：

ts—温度设定值误差，作为温度准确度，℃；

—为5次测量的平均值，℃；

t0—温度设定值，单位为摄氏度（℃）；

tc—控温稳定性，作为温度精密度，℃；

tmax—x次测量最大值，℃；

tmin——n次测量最小值，℃

注1：如色谱柱恒温箱具有制冷功能时，才需测试；注2：亦可通过计算机软件实时检测温度变化曲线，待仪器稳定后，记录温度曲线，计算温度准确度与精密度。

4.4检测器

4.4.1通用性能指标

4.4.1.1静态基线噪声与漂移

(1)设备与试剂

色谱数据工作站一套，纯水。

(2)测试方法

按照表3要求，设定仪器参数，连接测试系统。开机预热60min后，记录基线60min；取60min内平行包络线的中心线的起点与终点的差值作为检测器的基线漂移(如图1所示)；选取所记录基线中噪声较大的5min作为计算噪声的基线，以1min为界画平行包络线(如图2所示)，按式(4-10)计算短期基线噪声。5个包络线宽度的平均值，作为检测器基线噪声。

图1基线漂移计算示意图图2基线噪声计算示意图

4.4.1.2信噪比

(1)设备与试剂

色谱数据工作站一套；二元梯度系统一套(梯度误差不大于±1%)或1mL注射器一支；试剂：按照表4配制标准样品。

(2)测试方法

将检测器与二元梯度系统，以及色谱数据工作站连接好，按照表3设置仪器参数。开机预热后，以甲溶液为流动相A注入，1.0mL/min的流量平衡系统，冲洗流通池至示值稳定后归零。然后以乙溶液为流动相B注入流通池，检测器示值稳定后记录响应信号值，重复测试三次，取算术平均值。然后按式(4-11)计算信噪比(S/N)，噪声计算方法参照4.4.1.1。

....................................(4-11)

式中：

S/N—检测器信噪比；

H—检测器信号响应值；

N—基线噪声。

表4不同类型液相色谱检测器信噪比、线

4.4.1.3线性范围与灵敏度

(1)设备与试剂

色谱数据工作站一套；1mL注射器一支；试样：按照表4配制1个空白甲溶液，配制10个系列浓度丙溶液。如紫外-可见检测器配制试样甲溶液：纯水；试样丙溶液：丙酮水溶液浓度依次为0.1%、0.2%、0.3%、、1.0%。

(2)测试方法

将检测器和色谱数据工作站连接好，按照表3设置仪器参数。开机预热后，用注射器直接向检测池内注入表4甲溶液，冲洗检测池至示值稳定后将检测器回零。然后向检测池内依次注入表4乙溶液，充满检测池并使示值稳定，记录各浓度下的响应信号值，每个浓度重复测试三次，取算术平均值。以前五个浓度点和对应响应信号值作标准曲线，计算出后五点的理论响应值，与对应含量的响应信号值比较，响应信号值刚好大于计算值5%时，认为曲线弯曲，此点浓度作为线性上限CH。CL值测定(信噪比推算法)：以4.4.1.2测得结果线性推算信噪比为3时对应的浓度，即作为线性下限CL。

最后，由CH/CL算出检测器线性范围，CH值测定时标准曲线斜率作为检测器灵敏度。

4.4.2紫外-可见检测器/二极管阵列检测器

4.4.2.1波长准确度与精密度

(1)设备与试剂

色谱数据工作站一套，1mL注射器一支,氧化钬滤光片或0.4%氧化钬的10%高氯酸溶液：特征波长为nm，nm，nm。另外，亦可参照GB/T-，采用0.mg/mL重铬酸钾的0.05mol/L硫酸溶液(紫外吸收波长标准溶液，特征波长为nm，nm，nm和nm)测试。

(2)测试方法

将检测器和色谱数据工作站连接好，开机预热稳定后，将氧化钬滤光片放置在流通池处或将0.4%氧化钬的10%高氯酸溶液注入流通池进行光谱扫描，重复测试三次，记录并保存，计算谱线波峰的波长示值与特征波长值之差。按照此法依次检验各个特征波长的示值误差，取其中最大值作为检测器波长准确度。计算重复三次中最大值与最小值之差作为检测器波长精密度。

4.4.3示差折光检测器折光响应值准确度

4.4.3.1设备与试剂

色谱数据工作站一套；1mL注射器一支或恒流泵一台；0.mg/mL丙三醇水溶液（对应响应值为1×10-4RIU）和0.mg/L丙三醇水溶液（对应响应值为5×10-5RIU）.纯水。

4.4.3.2测试方法

将检测器和色谱数据工作站连接好，开机预热，首先将纯水注入参比池和样品池，冲洗稳定后归零；然后将0.mg/L和0.mg/L丙三醇水溶液依次注入样品池，示值稳定后，记录响应值，重复三次取算术平均值，最后与标准值比较，计算RIU与mV的对应关系。

4.4.4荧光检测器波长准确度与精密度

4.4.4.1设备与试剂

色谱数据工作站一套，1mL注射器一支。

纯水，或者1×10-4mg/mL萘甲醇溶液。

4.4.4.2测试方法

将检测器和色谱数据工作站连接好，开机预热稳定后，向检测池内注入纯水，待检测器示数稳定后，分别设定纯水拉曼光谱的激发/发射特征波长为nm/nm，进行激发和发射光谱扫描，重复测试三次，记录并保存光谱图。按照此法依次检验各个特征波长的示值误差，取其中最大值作为检测器波长准确度。计算重复三次中最大值与最小值之差作为检测器波长精密度。

另外，亦可采用1×10-4mg/mL萘甲醇溶液测试，激发/发射特征波长为nm/nm。

五、仪器整机性能指标的测试

5.1动态基线噪声与漂移

5.1.1设备与试剂

色谱数据工作站一套，阻尼管或测试用C18色谱柱一支(理论塔板数不低于)；

甲醇(色谱纯)或纯水。

5.1.2测试方法

按照表3要求，设定仪器参数，连接测试系统。启动系统，以甲醇或纯水为流动相，流量为1.0mL/min(对UHPLC，流量为0.2mL/min)，平衡稳定60min后，记录基线60min。然后按照4.4.1.1方法，计算动态基线噪声与漂移。

5.2梯度准确度与精密度

5.2.1设备与试剂

色谱数据工作站一套，紫外-可见检测器一台，两通一个，背压装置(10±2)MPa一套。丙酮(分析纯)，纯水；流动相：A，纯水；流动相B，0.1%丙酮/水溶液。

5.2.2测试方法

通过两通和背压装置将梯度系统与检测器相连，检测器波长设置为nm；色谱数据工作站与梯度系统、检测器信号输出端连接，按图3设置梯度参数。恒流泵总流量设为1.0mL/min，待仪器稳定后，开始采集数据，得到梯度曲线。测量各种溶液配比时的输出信号值，用公式(5-1)计算各种溶液配比时的梯度误差，取其中最大者为梯度准确度，重复三次，按照公式(5-2)计算梯度精密度。对于四元梯度系统采用同样的方法分别测定AB、AC、CD、BC、BD五组台阶梯度，每组重复三次。

5.3系统延迟体积

设备与试剂同5.2.1。

测试方法参照5.2.2，先以%流动相A，0.2mL/min平衡系统,基线稳定后，按照表5设置梯度程序，启动程序采集检测器信号，记录谱图并保存。然后在谱图上读取基线上扬拐点(50%响应信号处)对应的时间t(min)，按照公式(5-3)计算梯度系统延迟体积。

表5系统延迟体积梯度设置表

5.4密封性

参照4.1.3，测试点为压力上限90%，测试位置：(1)进样阀后，色谱柱前；(2)色谱柱后，检测池前。观察恒流泵压力降，滤纸检测是否有泄漏。

5.5重复性

5.5.1设备与试剂

色谱工作站一套,带20uL样品环(对于UHPLC，选择1uL样品环)的手动进样阀一个(配自动进样器则不需要)，合适规格的注射器一支(配自动进样器则不需要)，C18色谱柱一支(理论塔板数不低于)或阻尼管；试样参见表6;流动相为85%甲醇水溶液(样品色谱峰保留因子k值不低于3)或纯水。

5.5.2测试方法

仪器整机系统(包括恒流泵、检测器、色谱柱、进样系统、色谱工作站等)连接好，按照仪器系统配置的检测器类型选择流动相等测试条件和参数，见表3和表6。以85%甲醇水溶液为流动相，流量为1.0mL/min，基线稳定后注入20L相应的试样，记录保留时间和峰面积，连续7次。

注：对于UHPLC，色谱柱选择亚2um，2.1×50mm，流量设为0.2mL/min，进样量为1uL。

分别将保留时间、峰面积测试数据代入式(5-4)计算定性、定量重复性RSD值。

..................(5-4)

式中：

RSD—定性、定量重复性相对标准偏差；

Xi—第i次测得的保留时间或峰面积；

—n次测量结果的算术平均值；

i—测量序号；

n—测量次数(n＝7)。

5.6检出限与定量限

设备与试剂同5.5.1，试样按照表6选择。

测试方法参照5.5.2，基线稳定后注入相应的试样，采集谱图，记录色谱图中试样的峰高和基线噪声，重复三次取平均值。然后按式(5-5)、(5-6)计算，作为仪器的检出限(S/N=3)与定量限(S/N=10)。

式中：

cLOD—检出限，mg/mL(以最小检出浓度计)；cLOQ—定量限，mg/mL(以最小定量浓度计)；

Ni—动态基线噪声，AU（或V）；

c—样品浓度，mg/mL；H—样品峰高，AU（或V）；

V—进样体积，μL；

注：式中的数字“20”为标准的进样体积，μL。

5.7线性范围

设备与试剂同5.5.1，试样按照表6选择。

测试方法参照5.5.2，基线稳定后，由低到高，依次注入10个不同浓度相应的试样，采集谱图，每个浓度重复测试三次，取算术平均值。以前五个浓度点和对应峰面积作标准曲线，计算出后五点的理论峰面积，与对应含量的峰面积比较，峰面积刚好大于计算值5%时，认为曲线弯曲，此点浓度作为线性上限CH。以5.6测得的检测限作为线性下限CL。最后，由CH/CL算出检测器线性范围。

表6配置不同检测器时试样的选择

注：仍未达到线性拐点，则需加大或减小试样浓度后继续进行测。

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